Imperial University İle İşbirliği

Persistan gebelik yetmezliğine sahip hastalarda endometriyal desidual yanıtın karakterizasyonu

Projenin amaçları

Desidualizasyon olarak adlandırılan bir süreç olan gebeliğe hazırlıkta endometriyal stromal hücrelerin siklik farklılaşmasının tekrarlayan gebelik kaybı (RPL) hastalarında oldukça anormal olduğuna dair çok güçlü kanıtlar elde etmiş bulunmaktayız. Dolayısıyla, genel amacımız, müteakip gebelik yetmezliğini öngörebilen ve önleyebilen önyargı biyo-belirteçlerini ve stratejilerini tanımlamaktır. Bu teklifin özel hedefleri aşağıdaki gibidir:

• RPL’de anormal desidual hücre fonksiyonunun temelini oluşturan endometriyal stromal hücre epigenomunun ve transkriptomunun tanımlanması.
• RPL’ye sahip olan ve sahip olmayan kadınlarda embriyonik insan koryonik gonadotropin sinyaline desidual hücre yanıtlarını kontrol eden mekanizmanın tanımlanması.

Projeye zemin hazırlayan çalışma

Klinik geçmiş

Birçok memeli türler ile kıyaslandığında, insan üremesi önemli ölçüde etkisizdir. Bu büyük ölçüde yüksek embriyo kaybı insidansına atfedilebilir. Embriyo kaybının implantasyon öncesi %30 (implantasyon öncesi kayıp) ve 6 haftalık gestasyon öncesi %30 (klinik/biyokimyasal gebelik öncesi kayıp) olduğu tahmin edilmektedir. Buna ek olarak, çoğunlukla 12 haftalık gestasyon öncesi olmak üzere, klinik gebeliklerin %10’undan daha fazlası düşük ile sonuçlanmaktadır. Çiftlerin %1-2’si 3 ya da daha fazla konsekütif gebelik yetmezliği olarak tanımlanan tekrarlayan gebelik kaybı (RPL) yaşamaktadır. RPL fiziksel travmanın yanı sıra ciddi psikolojik morbidite ile ilişkilendirilmektedir. Hastalardan üçte biri klinik depresyon sebebiyle uzman kliniklere gitmektedir. Bir RPL geçmişi, müteakip bir devam eden gebelikte çeşitli advers obstetrik sonuçlar riskini de arttırmaktadır. Bu riskler arasında erken doğum, erken membran rüptürü, plasenta previa, düşük doğum ağırlığı ve konjenital malformasyon da bulunmaktadır.

Erken gebelik kaybı yaygın olarak embriyodaki kromozomal instabiliteye ya da maternal faktörlere atfedilebilen bir ikili bozukluk olarak görülmektedir. Öploid gebelik kaybının açıklanması için çok sayıda anatomik, endokrin, immünolojik, trombofilik ve genetik rahatsızlığın hatırlatılmış olmasına rağmen, hiçbiri spesifik ya da yaygın değildir. Ayrıca, bu koşullardan birçoğu için, persistan gebelik kaybına yol açan patolojik mekanizmalar tamamen farazidir. Konseptüsteki kromozomal dengesizliklerin tüm çocuk düşürmelerin yaklaşık olarak %50’sini açıkladığı tahmin edilmektedir. Bu karyotipik olarak anormal kayıplar yaygın olarak doğanın kaçınılmaz ‘kazaları’ olarak ve dolayısıyla tıbbi önlemenin ötesinde olarak kabul edilmektedir. Fakat, gebelik kaybına yönelik bu yenilgiyi kabul eden tutum, implantasyon öncesi insan embriyolarındaki kromozomal aberasyonun sıklığının ve karmaşıklığının kabul görenden çok daha yüksek olduğunu gösteren son çeşitli genom çalışmaları göz önünde bulundurularak sorgulanmalıdır. Bir üreme yetmezliği geçmişine sahip olmayan genç kadınlarda, klevaj aşaması embriyolarının %10’undan daha az bir kısmı tüm blastomerlerde normal bir karyotipe sahiptir, yaklaşık olarak yarısı hiç normal hücreye sahip değildir ve kalanı mozaiktir. İmplantasyon öncesi embriyolarındaki büyük kromozomal yeniden düzenlemelerin olağanüstü insidansı, ciddi şekilde risk taşıyan embriyoların implantasyonunun sınırlandırılması ve/veya kromozomal olarak mozaik embriyolardaki normal blastomerlerin pozitif seçiminin teşvik edilmesi için mekanizmaların mevcut olması gerektiğine işaret etmektedir. Bunun tersine, RPL hastalarındaki yüksek anöploidik gebelik prevalansı, birincil kusurun bu embriyo seçimi ve/veya ‘tamiri’ sürecinde olabileceğini ileri sürmektedir.

Doğal embriyo seçiminde endometriyal desidualizasyonun rolü

Endometriyum, implantasyonu menstruel siklusta birkaç gün ile sınırlandırarak, genişimsel olarak yetkin embriyoları tercihli olarak seçmekte ve böylece müteakip gebelik kaybını sınırlandırmaktadır. Bu kavram, ‘implantasyon penceresi’ olarak adlandırılan normal endometriyal alma eğilimi döneminin ötesindeki implantasyonun müteakip gebelik yetmezliğinde dramatik bir artış ile ilişkili olduğunu gösteren klinik gözlemlerle desteklenmektedir. İnsanlara ve diğer birkaç adet gören türlere özgü olarak, siklusun orta sekretuar evresi sırasındaki implantasyon penceresi, insan endometriyal stromal hücrelerinin (HESC’ler) uzman desidual hücrelere farklılaşmasına rastlamaktadır. Utrecht’teki iş arkadaşlarımız, bir insan ortak kültür sistemi kullanarak, desidual hale getiren HESC’lerin gelişimsel olarak bozulmuş embriyoları selektif olarak tanıdığını ve bir implantasyon medyatör panelinin salgılanmasını engelleyerek yanıt verdiğini bulmuşlardır. Farklılaşmamış hücreler bu gibi bir yanıta neden olmamaktadır. Bu da risk taşıyan gebe kalmaların tanınmasında ve eliminasyonunda HESC’lerin desidualizasyonunun hayati önem taşıdığı anlamına gelmektedir. Farklılaşan HESC’lerin embriyo kalitesinin kontrolü için biyosensörler olarak hizmet ettiği gözlemi, menstrüel dökülme süreci ile karışık olarak bağlantılı olan endometriyumun spontane siklik desidualizasyonunun, oldukça invaziv fakat kromozoma ait olarak kaotik insan embriyolarının implantasyonunun sınırlandırılması için hayati bir savunma mekanizması olarak ortaya çıkmış olabileceğini ileri sürmektedir.

Endometriyal desidualizasyon RPL’de bozulmaktadır

Yukarıdaki gözlemler temelinde, bozulmuş desidualizasyonun hem öploidik gebelik yetmezliğine neden olabileceği hem de embriyo tanınmasını ve seçimini etkisiz kılabileceği ve böylece gelişimsel olarak risk taşıyan gebe kalmayı kolaylaştırabileceği tahmininde bulunmaktayız. Bu hipotezi test etmek için, bir RPL geçmişine sahip olan ve sahip olmayan hastalardan birincil kültürlerde ve bunun yanı sıra zamanlı endometriyum biyopsilerde prokinetisin-1 (PROK1, endometriyal alma eğilimini veren bir sitokin) ve prolaktin (PRL, bir klasik desidual belirteç) transkript seviyeleri ölçülmüştür. Kontroller ile kıyaslandığında, RPL, endometriyal biyopsilerde yaklaşık olarak 100 kat daha düşük PRL seviyeleri ve önemli ölçüde daha yüksek PROK1 mRNA seviyeleri ile ilişkilendirilmiştir. Birincil HESC’ler bir desidual hale getiren stimülüse tabi tutulduğunda bu farklılıklar daha da aşikar olmuştur. PROK1 ve PRL mRNA seviyelerinin farklılaşmamış HESC’lerde ya da 48 saat boyunca desidual hale getirilmiş hücrelerde farklılık göstermemesine rağmen, 4 günlük farklılaşma sonrası, RPL örneklemleri ile kıyaslandığında, PRL transkript seviyelerindeki yükseliş kontrol gurubunda birkaç kat (1000 kat) daha yüksek olmuştur. PROK1seviyeleri 8. güne kadar tüm desidual hale getiren kültürlerde kıyaslanabilir kinetik ile yükselmeye devam etmiştir ve bu sürede RPL grubunda değil fakat kontrol grubunda ekspresyon önemli ölçüde düşmüştür. Kültürlenmiş hücrelerdeki bu ekspresyon profili, bozulmuş bir desidual yanıtın RPL’de uzun süreli endometriyal alma eğilimine yol açabileceğini desteklemektedir. Ayrıca tüm örneklemlerdeki ekspresyon paterni klinik presentasyona tekabül etmiş ve desidualizasyonun RPL’deki birincil kusur olduğunu ileri sürmüştür.

Embriyonik sinyallere desidual hücre yanıtları RPL’de bozulmaktadır

Fazla insan embriyolarının elverişliliğinin sınırlı olmasından dolayı, bu çalışmaların Utrecht’te takip edilmesine rağmen, insan embriyoları ile ortak kültür üzerine RPL hastalarından ve kontrollerinden bireysel birincil kültürlerin desidual fenotipinin incelenmesi henüz mümkün olmamıştır. Fakat embriyonik trofoblast tarafından salgılanan en erken ve en bol glikoproteinlerden bir tanesi olan insan koryonik gonadotropininin (hCG) PRL ve PROK1 ekspresyonu üzerindeki etkilerini incelemiş bulunmaktayız. Şekil X’te de gösterildiği gibi, RPL, desidual hale getiren HESC’lerde hCG sinyaline yanıt olarak PRL ve PROK1 ekspresyonunun paradoksal regülasyonu ile ilişkilidir. İn vivo duruma anlam çıkararak, bu gibi bir düzensiz yanıt, hCG olarak feto-maternal ara yüzeyin bütünlüğünü tehlikeye atacaktır. Bunun yanı sıra, erken gebelikteki lüteotropik eylemleri anjiyogenezi doğrudan uyarmakta ve maternal desiduadaki hücre ölümü yanıtlarını sınırlandırmaktadır.

Verilerimiz, gebelik hazırlığındaki endometriyal programlamanın RPL’de ciddi olarak bozulduğunu ve bunun yerleşik stromal hücrelerin bozulmuş desidualizasyonu, uzun süreli endometriyal alma eğilimi ve embriyonik sinyallere düzensiz bir maternal yanıt ile karakterize edildiğine dair çok güçlü kanıtlar sağlamaktadır. Bu patolojik yol hem kromozomal hem de kromozomal olmayan tekrarlayan gebelik kaybının temelini oluşturan yeni ve birleştirici bir mekanizma tesis etmekte ve advers gebelik sonucu riskine maruz kadınların tanımlanması amacıyla desidual yanıt kalitesinin öngörülmesi için ve önleyici tıbbi müdahalelerin etkinliğinin gözlenmesi için gebelik öncesi stratejilerinin geliştirilebileceğini göstermektedir.

Deneysel tasarım ve yöntemler

Hasta seçimi ve birincil kültürler

Birincil HESC kültürlerinin tesis edilmesindeki deneyimimiz 15 yıla yayılmaktadır. Sadece geçen yıl içinde, RPL ve RPL olmayan hastalardan sırasıyla 71 ve 87 endometriyal örneklemler işlemiş bulunmaktayız. Hastalar Imperial College Healthcare NHS tröstü içindeki uzman üreme ve tekrarlayan çocuk düşürme kliniklerinden kabul edilmekte ve standart poliklinik protokollerine göre araştırılmaktadır. Fakat katılımcıları kabul ederken ya da müteakip veri analizinde bu standart araştırmaların sonucu rutin olarak alınmamaktadır. Birincil HESC kültürleri, daha önce de tanımlandığı gibi, rekombinant hCG varlığında ya da yokluğunda, .5 mM 8-Br-cAMP (Sigma) ve 10-6 µM MPA (Sigma) ile tesis edilecek ve desidual hale getirilecektir. Buna ek olarak, bir desidual fenotipi ifade edebilen yeni bir telomeraz-ölümsüzleştirilmiş HESC hattı olan St-T1b’yi oluşturmuş ve karakterize etmiş bulunmaktayız. St-T1b hücreleri tekniklerin optimum hale getirilmesi için kapsamlı olarak kullanılmaktadır. Son olarak, iş arkadaşımız Profesör Quenby (Warwick Üniversitesi), 600’ün üzerinde fenotip örneklem içeren endometriyal biyo-bankasına erişim sağlamamızı kabul etmiştir.

RPL’de desidual yanıtın karakterizasyonu

RPL’de desidual gen ekspresyonu profillemesi Gerekçe. RPL’deki desidual yanıt şimdiye kadar bir aday gen yaklaşımı kullanılarak değerlendirilmiştir. Biz ve diğerleri, hem in vitro hem de in vivo olarak, desidual gen ekspresyonunun genom profillemesi için mikrodizi platformları kapsamlı olarak kullandık. Bu yaklaşımı hedefe yönelik gen knockdown ile birleştirerek, FOXO1 gibi kilit cAMP’a bağlı transkripsiyon faktörleri ve spesifik steroid reseptörler (progesteron ve androjen reseptörler) kontrolü altında hücresel fonksiyonları ve desidual gen ağlarını karakterize ettik. Böylece, RPL ile ilişkili desidual gen ekspresyonu profilini tanımlayarak ve bunu mevcut veri dizilerine dahil ederek, bilgilendirici belirteç genleri tanımlayabilecek ve RPL’de desidual hücre fonksiyonlarını ve sinyal yollarını betimleyebileceğiz.

Deneysel yaklaşım.

8 gün boyunca desidual hale getirilmiş birincil farklılaşmamış HESC’lerden ve hücrelerden toplam RNA mikrodizi analizine tabi tutulacaktır (Affymetrix Gene ST Array, Almac Diagnostics). Örneklemler arasındaki biyo-değişkenliğin ve bunun yanı sıra maliyetin azaltılması için, test edilecek olan koşulların her biri için 3 farklı birincil kültürden (farklılaşmamış/desidual hale getirilmiş ve kontrol/RPL) oluşan 4 havuz tesis edeceğiz. Gen ekspresyonundaki maksimum farklılıkların yakalandığından emin olmak için 8 günlük zaman noktası seçilmektedir. Bağımsız süreç deneylerinde bilgilendirici genlerin ekspresyonunu geçerli hale getirmek için gerçek zamanlı kantitatif (RTQ)-PCR kullanılacaktır. Daha sonra standart moleküler yaklaşımlar kullanılarak fonksiyonel seviyede (örneğin hücre siklus kontrolü, apoptoz, migrasyon, sitokin ekspresyonu, vs.) test edilecek olan farklılaşmış olarak ifade edilen gen ağlarının biyolojik önemini sorgulamak için Ingenuity Pathways Analysis (IPA, Ingenuity Systems) kullanılacaktır.

RPL’deki endometriyal epigenom Gerekçe. Yukarıda özetlendiği gibi, RPL hastalarından orta sekretuar biyopsilerindeki aberant PRL ve PROK1 ekspresyonu, siklusta rastgele alınan örneklemlerden tesis edilen ve uzun süreli kültürde muhafaza edilen pürifiye HESC’lerin desidualizasyonu üzerine yinelenmiş ve hatta güçlendirilmiştir. Bu gibi hücresel ‘hafıza’ endometriyal farklılaşmanın epigenetik programlamaya tabi olduğunu ileri sürmektedir. Bazı epigenetik belirtiler mitotik olarak kalıtımla geçebilmektedir ve böylece hücre hafızasına katkıda bulunmaktadır. Bazı epigenetik belirtiler ise aşırı dinamiktir ve sinyal olaylarına hızlı bir şekilde yanıt vermektedir. Birçok ön veri desidual sürecin HESC’lerin epigenetik yeniden programlamasına bağlı olduğunu ve RPL’de karıştığını belirtmektedir. İlk olarak, mevcut dizi verilerinin manuel olarak araştırılması, desidualizasyonun regüle edilmiş DNA metiltransferazı (DNMTs), mCpG bağlayıcı proteini ve histon-lisin metiltransferazı ekspresyonu ile ilişkili olduğunu belirtmiştir. İkinci olarak, havuzlanmış RPL ve RPL olmayan kültürlerin Western blot analizi, bu aşağı regülasyonun kinetiklerinin daha önceden RPL örneklemlerinde meydana gelmiş olmasına rağmen, desidualizasyon üzerine, hücre bölünmesi sırasında metilasyon paternlerinin muhafaza edilmesinden ve doğru replikasyonundan sorumlu olan DNMT1 ekspresyonu kaybını göstermiştir. Ayrıca gen ekspresyonu ya da susturma ile ilişkili kilit histon modifikasyonlarını incelemek için kromatin immünopresipitasyon (ChIP) analizini kullandık. Şekil X’te gösterildiği gibi, kontrol kültürlerinin desidualizasyonu, histon H4 kuyruk asetilasyonunun (acH3, bir aktivasyon belirtisi) zenginleştirilmesi ve desiduaya özgü PRL promotör üzerinde histon H3 (H3K27me3) üzerinde baskılayıcı lisin 27 trimetilasyonu kaybı ile ilişkilendirilmiştir. Önemli biçimde, bir RPL kültüründe bu ikili belirtilerin analizi, desidualizasyon üzerine PRL promotör loküsünde paradoksal bir acH3 kaybını ortaya çıkarmıştır. Bu gözlemlerin daha geniş örneklem dizilerinde doğrulama gerektirmesine rağmen, veriler, RPL’deki aberant gen ekspresyonunun HESC epigenomundaki farklılıklar tarafından desteklendiğini ileri sürmektedir.

Deneysel yaklaşım.

Perturbe desidual gen programı, aberant DMNT1 ekspresyonu ve acH3 gibi histon belirtilerinin bozulmuş regülasyonu göz önünde bulundurulduğunda, desidual hücre epigenomunun RPL’de farklılaşacağını öngörmekteyiz. Değişmiş CpG metilasyonunu gösteren promotörleri tanımlamak için bir genom geneli yaklaşım kullanılacaktır. İşlenmemiş ya da 8 gün boyunca desidual hale getirilmiş olmak üzere, RPL HESC’lerinden ve kontrolden hazırlanan DNA, metilat DNA immünopresipitasyonuna (MeDIP) tabi tutulacak ve 3x720K RefSeq Promotör Dizilerine (Nimblegen) tabi olarak melezleştirilecektir. Bu genom genelindeki metilasyon çalışmaları Psikiyatrik Epigenetik Öğretim Görevlisi (IoP, King’s College Londra) Dr Jonathan Mill ile işbirliği halinde yürütülecektir. Bilgilendirici genlerin promotör bölgelerindeki CpG metilasyonu değişikliklerinin kinetiklerinin incelenmesi için pirosekanslama öncesi bisülfit işlemi kullanılacaktır. Bu yaklaşımın tamamlayıcısı olarak, in vitro ve zamanlı endometriyal örneklemlerde, regüle mCpG bağlayıcı proteinlerin (örneğin UHRF1, HELLS) ve varsayılan DNA metilazlarının (örneğin GADD45A) yanı sıra, tüm DNMT’lerin ekspresyonunu profilleyeceğiz ve overekspresyon ve/veya siRNA knockdown yaklaşımlarını kullanarak dinamik metilasyon olaylarında bunların rolünü inceleyeceğiz. Çok sayıda histon modifikasyonu nedeniyle, öncelikle genom geneli kromatin haritalamayı göz önünde bulundurmadan önce bilgilendirici belirtileri tanımlamak için hedefe yönelik bir yaklaşım kullanılacaktır. Desidualizasyon bağlamında, RPL ve kontrol hastalarından birincil kültürlerin desidualizasyonu üzerine, PRL ve PROK1 (ve muhtemelen dizide tanımlanan diğer oldukça farklılaşmış şekilde ifade edilen genler) promotör bölgesindeki ikili modifikasyonlardaki (örneğin H3K4me2/3, H3K9Ac, H3Ac ve H3K27me3) değişiklikleri gözlemek için ChIP analizini kullanacağız. HESC’lerdeki hücresel hafızaya merkezi olan tek ya da birleşimsel belirtilerin açığa çıkarılması için genişletilmiş bir ekran gerekli olabilir. Bu ekranın yönlendirilmesi için birçok tamamlayıcı yaklaşım benimsenecektir. İlk olarak, daha sonrasında spesifik bilgilendirici belirtilere işaret edebilecek olan bilinen kromatin değiştirici enzimlerin farklı ekspresyonu için RPL ve kontrol hastalarından farklılaşmamış HESC’lerin gen dizisi verileri (yukarıya bakınız) araştırılacaktır. RPL ile ilişkili posttranslasyonel histon kodundaki global değişiklikler, doku bölümlerinin immünohistokimyası ile ve nükleer ekstraktların Western blot analizi ya da immünofluoresan eşodaklı mikroskopisi ile birincil kültürlerde değerlendirilecektir. Ayrımcı global değişikliklerin olmaması halinde, RPL hastalarından ve kontrollerden HESC’lerde farklılaşmış şekilde ifade edilen düzenlenmemiş aday genlerin promotörleri, transkripsiyonel olarak permisif ökromatin ya da baskılayıcı heterokromatin ile ilişkili histon belirtileri için gösterilecektir. Eğer bilgilendirici ise, ChIP ve masif paralel sekanslamayı (ChIP-Seq) birleştirerek, analizi genom genelinde ölçeğe genişleteceğiz. Bu teknik, biyoenformatik desteğin yanı sıra teknik yardım sunmayı kabul etmiş olan Profesör Malcolm Parker’in (IRDB, Imperial) laboratuarında uygulanmaktadır. Son olarak, spesifik loküslerdeki bilgilendirici epigenetik modifikasyonların translasyon potansiyeli, RPL ve RPL olmayan hastalardan köreltilmiş tam doku endometriyal biyopsilerden ekstrakte edilmiş DNA üzerinde test edilecektir. RPL’de hCG sinyali ve endometriyal yanıtlar Gerekçe. Embriyonik hCG sinyaline paradoksal emdometriyal yanıtlar persistan gebelik kaybında majör bir mekanizma teşkil edebilir. hCG sinyali hCG/LH (lüteinleyici hormon) reseptörü (hCG/LHR) tarafından yöneltilmektedir. Fakat, endometriyal hücrelerdeki aşağı sinyal yolları büyük ölçüde bilinmemektedir. Ön verilerimiz, endometriyal hCG/LHR’nin ve bu reseptör tarafından aktive edildiği daha önceden rapor edilmemiş olan bir G proteini sinyal yolunun birleştirildiğini belirtmektedir. hCG işlemi hem farklılaşmamış hem de desidual hale getirilmiş HESC’lerde hızlı Gαi aktivasyonunu tetiklemiş ve Gαi inhibitör boğmaca toksini tarafından ters çevrilen Forskoline bağlı cAMP üretiminin engellenmesi ile sonuçlanmıştır. hCG/LHR sadece farklılaşmamış hücrelerde bir HESC alt popülasyonundaki kalsiyum sinyalini de aktive etmektedir. Ayrıca, pek çok kanıt göstermektedir ki hCG/LHR farklılaşmamış hücrelerde konstitütif aktivite sergilemektedir. Sadece Forskolin tedavisi ile kıyaslandığında, boğmaca toksini tedavisi uyarılmamış cAMP yanıtını arttırmaktadır. İmmüno reaktif hCG/LHR, SDS-PAGE üzerinde daha yüksek bir moleküler ağırlıkta göç etmektedir (muhtemelen fosforilasyonu yansıtmaktadır) ve liganddan bağımsız içselleştirme sergilemektedir. Bu konstitütif aktivite HESC desidualizasyonu üzerine ters çevrilmiş gözükmektedir. Herhangi bir sistemde bir GPCR için bu gibi bir aktivite değişikliği gözlemlenmemiştir. Bu gözlemler temelinde, konstitütif reseptör aktivasyonunun, farklılaşmamış hücrelerde cAMP’a yanıt veren genlerin uygun olmayan ekspresyonunu önleyen bir mekanizma olarak hizmet edebileceğini ve desidualizasyon üzerine hücresel çevrenin yeniden programlanmasının hücre yüzeyi üzerindeki reseptörü stabilize ettiğini ve böylece endometriyumu başarılı implantasyon üzerine embriyonik sinyaller için hazırladığını ileri sürmekteyiz. Bu hipotezi test etmek için, hCG sinyal transdüksiyonuna dahil olan yolların ve mekanizmaların derinlemesine bir karakterizasyonu ile tamamlanan, RPL ve RPL olmayan hastalardan HESC’lerin desidualizasyonunda hCG’ye transkripsiyonel yanıtları tanımlamak amacıyla gen ekspresyonu çalışmaları gerçekleştireceğiz. Bu birleştirilmiş yaklaşım, erken gebelik kaybının önlenmesi için kullanılabilecek olan yeni hedefleri ortaya çıkarabilir.

Deneysel yaklaşım

(a) RPL ve kontrollerden HESC’lerin desidualizasyonunda hCG yanıtlarının karakterizasyonu. RPL ve kontrol kültürlerinde PRL ve PROK1 gibi desidual belirteç genlerinin hCG regülasyonu, müteakip genom çapında ekspresyon profillemesi için en bilgilendirici koşulların belirlenmesi için RTQ-PCR tarafından süre ve doz-yanıt deneylerinde daha fazla araştırılacaktır. Mikrodizi analizinin tasarımı (iia) bölümünde özetlenene benzer olacaktır. Dizide tanımlanan yeni bilgilendirici genler ve PRL gibi desidual genlerin regülasyonunda hCG/LHR yoluyla Gi sinyalinin önemini tanımlamak için, HESC’lerin desidualizasyonunda hCG’ye transkripsiyonel yanıt, hCG/LHR’nin siRNA aracılı knocdown’ı üzerine ve boğmaca toksini ile ortak tedavi üzerine incelenecektir. Müteakip hCG/LHR karakterizasyonu ve sinyal transdüksiyonu mekanizması RPL hastalarından birincil hücrelerde test edilen kilit bulgular ve kontrol HESC kültürlerinde gerçekleştirilecektir.

(b) HESC’lerde hCG/LHR’nin karakterizasyonu. Western blot analizi, HESC’lerde ifade edilen baskın hCG/LHR formunun diğer hücre tiplerinde ifade edilen matür hücre yüzeyi reseptöründen farklılık gösterdiğini belirtmiştir. Bu da bir ek değişkesinin ekspresyonunu ya da reseptörün farklı glikosilasyonunu öne sürmektedir. Bu ihtimaller arasında ayrım yapmak için, sırasıyla hücre yüzeyi reseptörü ve endoplazmik retikulum arasında ayrım yapan PNGase F ve EndoH endoglikozidazları ile HESC lizatlarını tedavi edeceğiz. C terminal ucu, transmembran domenleri, hinge bölgesi eksik kısmı, şiddetli şekilde kesilmiş biçimler ve reseptörün N terminal donemi için kodlayan eksonsuz değişkeler de dahil olmak üzere dört farklı hCG/LHR ek değişke tanımlanmıştır. mRNA seviyesindeki hCG/LHR ek değişkelerin ekspresyonu RT-PCR tarafından belirlenecektir. Bir reseptör değişkesini kodlayan cDNA, değişkenin muhtemel baskın negatif fonksiyonunun belirlenmesi için sokak türü reseptör ile birlikte ya da tek başına, bir ekspresyon vektörüne (pCDNA3.1) klonlanacak, bir heterolog hücre sistemine (örneğin HEK293) transfekte edilecek ve fonksiyonel olarak değerlendirilecektir.

(C) HESC’lerde hCG/LHR sinyal kompleksinin karakterizasyonu. HESC’lerde hCG/LHR aktivitesini yöneten etkileşen moleküler makineyi karakterize etmek için, bir proteomik yaklaşım kullanacağız. Endojenöz reseptör farklılaşmamış ve desidualizasyon HESC’lerinden immünopresipite edilecektir (IP). Eğer yeterli verim alınamazsa, anti-FLAG antikorları ile bir FLAG işaretli endometriyal hCG/LHR ve IP ifade edeceğiz. LHR ile ilişkili proteinlerdeki değişikliklerin tanımlanması için hem 1D hem de 2D gen yaklaşımları kullanılacaktır. İlgili bantlar/noktalar MALDI-ToF ve LC/MS/MS (Q-ToF) kitle spektrometrisi tarafından analiz için Glycotric/Mass Spec Facility’ye (Imperial College) gönderilecektir. Ortak IP ve biyoluminesans rezonans enerji transferi (BRET) kullanılarak protein etkileşimleri doğrulanacaktır. BRET, akseptör işaretli (YFP) proteinler ile donor işaretli (Renilla Luciferase) proteinler arasındaki gerçek zamanlı etkileşimleri ölçmektedir ve düşük seviyeli ve/veya geçici etkileşimlerin algılanmasında FRET’ten daha hassastır. PDZ proteini GIPC gibi bilinen hCG/LHR etkileşen partnerlerinin fonksiyonel analizi ile proteomik ekran tamamlanacaktır. PDZ proteinleri bir hücre plazma membran iskele fonksiyonu sağlamaktadır ve hücrelerin desidualizasyonunda yüzeydeki hCG/LHR’yi stabilize etmek için hareket edebilir. hCG/LHR ile ilgili olarak GIPC’nin hücresel dağılımı, farklılaşmamış ve desidual hale getirilmiş hücrelerde eş odaklı mikroskopi tarafından görselleştirilecektir. Fonksiyonel olarak, hCG/LHR aktivitesi üzerinde GIPC’nin siRNA aracılı knockdown’ının etkisi, hCG’ye bağlı Gi sinyalinin ölçümü tarafından (EIA cAMP kit, Deney Tasarımları) ve konstitütif reseptör trafiği üzerinde değerlendirilecektir.

(d) HESC’lerde hCG/LHR trafiği. GPCR’lerin membran trafiği hücresel sinyal paternlerini kritik olarak tanımlamaktadır. Agoniste bağlı içselleştirme hızlı sinyal desensitizasyonuna, hormonal sinyal resensitizasyonuna ya da geri kazanımına, reseptörlerin aşağı regülasyon için lizozoma ayrılmasına ve hatta endozomdan G olmayan protein sinyal yollarının aktivasyonuna katkıda bulunmaktadır. Desidualizasyon HESC’lerinde hCG’ye bağlı içselleştirme eksikliği, aşağı gen ekspresyonunu regüle eden bir sinyal paterninin tanımlanmasının ve/veya erken gebelik aşamalarında hCG’ye bağlı sinyalin muhafaza edilmesinin bir yolu olarak, reseptörün desensitizasyona dirençli olabileceğini öne sürmektedir. hCG’nin hızlı reseptör desensitizasyonunu başlatabilmesi, tekrarlayan hCG yüklemeleri sonrası sinyal kabiliyeti ile ölçülecektir. Ayrıca hCG’nin kronik hCG tedavisi altında HESC’lerde uzun süreli aşağı regülasyonu başlatma kabiliyeti Western blot analizi tarafından belirlenecektir. Desidualizasyon hüzrelerinde içselleştirmeye ve muhtemelen aşağı regülasyona direnç ligandlı reseptörün arrestin gibi endositik adaptörleri kabul etmediğini ileri sürmektedir. Bu, farklılaşmamış ve desidualizasyon HESC’lerinde GPCR kinazları (GRK’ler) ve arestin ekspresyon seviyelerinin ölçülmesi ve hCG/LHR desensitizasyonu/içselleştirmesi ve sinyali üzerinde bu proteinlerin overekspresyonunun etkisinin gözlenmesi yoluyla incelenebilir. Bir araya getirildiğinde bu deneyler HESC’lerdeki hCG sinyalinin ilk derinlemesine analizini temsil edecektir ve RPL ve RPL olmayan endometriyal hücrelerde hCG/LHR fonksiyonunun kıyaslanması erken gebelik kaybının önlenmesi için tedavi hedeflerini ortaya çıkarabilir.