Συνεργασία με Ξένα Ιδρύματα (Hammersmith Hospital)

28 χρόνια μετά τη γέννηση της Louise Brown η εξαιρετική πρόοδος που έχει συντελεστεί στον τομέα της αντιμετώπισης της ανθρώπινης υπογονιμότητας, μας δίνει το δικαίωμα βάσιμα να υποστηρίζουμε πως για τη συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών υπάρχουν ρεαλιστικές λύσεις και θεραπευτικές διέξοδοι. Την ίδια όμως στιγμή δεν πρέπει να ξεχνάμε πως παρ΄όλες τις ραγδαίες επιστημονικές εξελίξεις και τα θεαματικά επιτεύγματα που έχουν σφραγίσει το χώρο της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής, η θεραπεία της υπογονιμότητας, όπως αποτυπώνεται στα τελικά ποσοστά γέννησης ζώντων νεογνών ανά προσπάθεια, έχει ακόμα σημαντικά περιθώρια βελτίωσης.

Καθώς λοιπόν σε παγκόσμιο επίπεδο η συντονισμένη ερευνητική προσπάθεια όσων δραστηριοποιούνται στο χώρο επικεντρώνεται στη βελτιστοποίηση όλως των βημάτων της θεραπείας και στον έλεγχο των αστάθμητων παραγόντων ( π.χ. πρωτοπόρες τεχνικές, αναβάθμιση εργαστηριακών συνθηκών, ανάπτυξη νέων καλλιεργητικών υλικών κλπ) καθίσταται σαφές πως κεντρικό ρόλο στην τελική επιτυχία της προσπάθειας κατέχει η παράμετρος «εμφύτευση του εμβρύου». Ουσιαστικά πίσω από αυτό τον όρο κρύβεται μία συναρπαστική διαδραστική επικοινωνία μήτρας και εμβρύου που κορυφώνεται 5 έως 9 ημέρες μετά το κύμα LH, όταν «ανοίγει το παράθυρο εμφύτευσης». Και όμως, παρά τις αυξημένες γνώσεις των τελευταίων ετών, οι συγκεκριμένοι μηχανισμοί και η ενορχηστρωμένη αλληλουχία των μεταβολών που απαιτούνται σε αυτή την κρίσιμη περίοδο, κρύβουν ακόμα πλήθος μυστικά και δημιουργούν ερωτηματικά σε όλους μας.

Η διαδικασία της εμφύτευσης παραδοσιακά διαχωρίζεται στα στάδια apposition-εναπόθεση, adhesion- προσκόλληση, penetration- διείσδυση, invasion- κατάδυση και προυποθέτει αφ’ ενός επιτυχημένο blastocyst hatching, αφ’ ετέρου την ανάπτυξη ενός σύνθετου χημικού διαλόγου της βλαστοκύστης με τους μητρικούς ιστούς. Τροφοβλάστη και φθαρτός παράγουν έναν μεγάλο αριθμό Growth Factors, κυτοκινών και παρακρινικών ουσίων (Platelet Derived GF, Epidermal GF, IGF, TGF, Colony Stimulating Factor, Interleukines) ενώ ταυτόχρονα αναπτύσσουν αντίστοιχους υποδοχείς για αυτά τα μόρια.

Φαίνεται πως υπεύθυνες για την αρχική προσκόλληση είναι ουσίες που καλούνται integrins και cadherins. Δύο ιντεγκρίνες , η α4β1 και η α5β1, παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαφή με φιμπρονεκτίνες στο επίπεδο της βασικής μεμβράνης των αδενικών κυττάρων αφού με τη βοήθεια κολλαγόνου, φιμπρίνης και ηπαρίνης σχηματίζουν ένα ενδοκυτταρικό δίκτυο που τελικά οδηγεί σε μειωμένο επίπεδο φιμπρονεκτίνης στο στρώμα του φθαρτού.

Η μετάπτωση του εκκριτικού ενδομητρίου σε φθαρτό, με την συντονισμένη δράση οιστρογόνων και προγεστερόνης, συνοδεύεται από σημαντικό πολλαπλασιαμό των ΝΚ- like cells ώστε να αποτελέσουν τα 2/3 της συνολικής συγκέντρωσης των λευκοκυττάρων του φθαρτού τη στιγμή της εμφύτευσης. Τα CD3+cells αποτελούν περίπου το 20% του λευκοκυτταρικού πληθυσμού, με τα υπόλοιπα λευκά κύτταρα να είναι τα CD14+μακροφάγα. Τα εμβρυικά κύτταρα δεν εκφράζουν ΑΝΤΙΓΌΝΑ HLA class 1 με συνέπεια να απουσιάζουν απορριπτικοί παράγοντες. Αντίθετα, εκφράζουν HLA-G αντιγόνα που ως μία ποικιλία των μορίων HLA class 1 αντιπροσωπεύουν ένα κρίσιμο υπο-πληθυσμό που μελέτες αναδεικνύουν ως μοναδικό στην εμφυτευόμενη τροφοβλάστη. Εχει υποστηριχθεί ότι η αντίδραση μεταξύ HLA-G και μητριαίων ΝΚ cells μπορεί να ρυθμίσει την τροφοβλαστική διείσδυση με την παραγωγή «συναγωνιστικών και ανταγωνιστικών σημάτων» που επηρεάζουν την όλη διαδικασία.

Επιφανειακά φωσφολιπίδια (φωσφοεθανολαμίνη, φωσφοσερίνη) και ενδομιτοχονδριακά φωσφωλιπίδια (καρδιολιπίνη) παράγονται από την κυτταροτροφοβλάστη παίζοντας ένα κεντρικό ρόλο στη διαδικασία της συγκυτιοποίησης που είναι κρίσιμη για την επιβίωση του εμβρύου, αφού αντισώματα έναντι αυτών των φωσφολιπιδίων ματαιώνουν την εμφύτευση. Εξάλλου παρόμοια αντιφωσφολιδικά αντισώματα δημιουργούν ένα περιβάλλον αυξημένης πηκτικότητας που συνδυασμένο με αλλοιώσεις της CRP οδηγούν σε καταστροφικές ενδαγγειακές θρομβώσεις με μοιραίο αποτέλεσμα.

Για την πλήρη κατανόηση και ανάλυση της φυσιολογικής ή παθολογικής εμφύτευσης, το πιο ουσιαστικό βήμα είναι η λεπτομερής αποκάλυψη της διαδικασίας σε μοριακό και ανοσολογικό επίπεδο. Δυστυχώς προς το παρόν, οι ερευνητικές προσπάθειες δεν έχουν καταλήξει σε ξεκάθαρη αποτύπωση των βιοχημικών μηχανισμών καθώς οι παράγοντες που συμμετέχουν και οι αλληλοσχετίσεις τους δεν μπορούν με σαφήνεια να αξιολογηθούν και άρα δε μπορούν να μας οδηγήσουν στην ανάπτυξη συγκεκριμένων ανά περίπτωση θεραπευτικών πρωτοκόλλων. Είναι χαρακτηριστικό ότι σε προβλήματα «implantation failure» έχουν, άλλοτε εμπειρικά και άλλοτε επί τη βάσει ερευνητικών δεδομένων, χρησιμοποιηθεί ποικίλες θεραπευτικές προσεγγίσεις όπως προφυλακτική σαλπιγγεκτομή, assisted hatching, PGD & aneuploidy screening, blastocyst culture & transfer, co-culture methods, χορήγηση ηπαρίνης, ασπιρίνης, LIF κλπ, χωρίς πάντα την αναμενόμενη επιτυχία.

Εκτιμώντας πως η υποδεκτικότητα του ενδομητρίου καθορίζεται από αλληλορυθμιζόμενες, συγχρονισμένες αλλαγές της έκφρασης των πρωτεινών του, σε συνεργασία με τον Καθηγητή Jan Joris Brosens, (Professor of Reproductive Sciences, Imperial College, London,UK) προχωρήσαμε στον σχεδιασμό της ακόλουθης μελέτης με σκοπό την περαιτέρω βασική έρευνα της διαδικασίας εμφύτευσης, ειδικά σε περιστατικά << recurrent implantation failure>>.

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Η microarray analysis είναι χρήσιμη για την ταυτοποίηση ομάδων γονιδίων που εμπλέκονται στην υποδεκτικότητα του ενδομητρίου αλλά η συγκεκριμένη τεχνική είναι περιορισμένης εμβέλειας λόγω της μικρής σχέσης mRNA και επιπέδου πρωτεινών. Χρησιμοποιούμε τεχνολογία πρωτεινικών biochip υψηλής συγγένειας με σκοπό την ταχεία πρωτεομική ανάλυση του ενδομητρίου γόνιμων γυναικών , γυναικών με ανεξήγητη υπογονιμότητα, επαναλαμβανόμενες αποτυχίες εμφύτευσης και επαναλαμβανόμενες απώλειες κυήσεως. Παράλληλα, χρησιμοποιούμε τεχνολογία laser capture microdissection με σκοπό την ανεύρεση του πρωτεινικού προφίλ αδενικών τμημάτων και στρώματος καθώς και καλλιέργειες ώστε να ανιχνευθούν νέες στεροιδικές ορμονο-εξαρτώμενες πρωτείνες.

Οι πρωταρχικοί σκοποί είναι η ταυτοποίηση πρωτεινικών δικτύων που σχετίζονται με φυσιολογική και παθολογική ενδομήτρια υποδεκτικότητα έτσι ώστε τελικώς να έρθουν στο φως εν δυνάμει διαγνωστικοί δείκτες και κατ’επέκταση θεραπευτικοί στόχοι. Η μελέτη έχει 4 πειραματικά βήματα.

1. Ταχεία ανίχνευση (fingerprinting) πρωτεινών ενός μικρού αριθμού δειγμάτ ων γυναικών με σοβαρά αναπαραγωγικά προβλήματα.
2. Αξιολόγηση του προφίλ discriminatory πρωτεινών με τη χρήση μιας ευρύτερης ομάδας δειγμάτων <<τυφλών>> βιοψιών.
3. Μοριακή ταυτοποίηση των πρωτεινικών fingerprints.
4. Ενσωμάτωση των πρωτεινικών δεδομένων με τη χρήση bioinformatics analysis.

Μεταξύ των κύριων αρχικών ευρημάτων είναι η ανίχνευση σταθερών, συγκεκριμένων πρωτεινικών αλλαγών στο εκκριτικό ενδομήτριο γυναικών με επαναλαμβανόμενες απώλειες κυήσεως.

ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ

Η μελέτη έχει 2 σκέλη-φάσεις. Ο σχεδιασμός παρουσιάζεται ακολούθως:

Βλέπε sides.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ

Κριτήρια εισαγωγής στην ομάδα ελέγχου

-κανονικός, τακτικός,ομαλός γεννητικός κύκλος 25-35 ημερών

-αποδεδειγμένη γονιμότητα με τουλάχιστον ένα ζων τέκνο

-χωρίς χρήση IUCD, αντισυλληπτικών χαπιών ή άλλου ορμονικού σκευάσματος για 3 τουλάχιστον μήνες προ της βιοψίας.

Κριτήρια εισαγωγής στην ομάδα μελέτης

-ηλικία 18-43 ετών

-κανονικός,τακτικός, ομαλός γεννητικός κύκλος 25-35 ημερών

-ασθενής με πρωτοπαθή ανεξήγητη υπογονιμότητα

-προγεστερόνη ορού > 20nnol/l κατά τη μέση ωχρινική φάση

Κριτήρια αποκλεισμού για τις 2 ομάδες

-κλινικώς σημαντική συστηματική νόσος(ηπατική, νεφρική, καρδιαγγειακή)

-μη τακτική έμμηνος ρήση

-ενδομητρίωση σταδίου 2-4

-ανώμαλη γυναικολογική αιμορραγία αγνώστου αιτιολογίας

-Χρήση creational drugs ή κάπνισμα άνω των 20 τσιγάρων ημερησίως

-Χρήση θεραπειών που επηρεάζουν τον υποθάλαμο-υποφύσιο-ωοθηκικό άξονα π.χ. αντισυλληπτικά χάπια